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但近年來,海內外學者接踵報道了DHV-Ⅰ型的變異情況,Barnhardt株是在美國一個農場分離到的一個顯著的血清學變異株,與DHV-Ⅰ型在中和試驗中呈部門交叉反應。在福州地區發現不能被尺度DHV-Ⅰ型疫苗保護的鴨肝炎。蘇敬良等從疑似鴨肝炎的病死鴨體內分離到1株與Ⅰ型、Ⅲ型鴨肝炎病毒無血清學交叉免疫反應的小RNA病毒,暫時將其病毒稱為新型鴨肝炎病毒。


  在該病的診斷上,依據其發病日齡、臨床癥狀和病理變化可做出初步診斷,但確診和病毒定型必需依靠進一步的病原學和血清學診斷。目前,應用于DHV的血清學診斷主要有中和試驗、酶聯免疫吸附試驗、瓊脂免疫擴散試驗、間接血凝試驗和免疫熒光等,下面就近年來的診斷方法做扼要概述。


1 臨床診斷


  該病主要發生于3周齡以下的雛鴨,潛在期短,常溘然發病,感染雛鴨首先表現為跟不上群,此后短時間內就休止運動,蹲伏并半閉眼。病鴨身體側臥、兩腿痙攣后踢,頭向后背,呈角弓反張樣。雛鴨在泛起癥狀后1 h左右就發生死亡。


  剖檢特征性病變主要在肝臟,常表現為肝臟腫大、質脆,外觀淡紅、土黃或斑駁狀,表面有彌漫性出血點或出血斑;膽囊腫脹呈長卵圓形布滿膽汁,膽汁常呈褐色或淡茶色;脾臟和腎臟也多有不同程度的腫脹,表面有出血點或呈斑駁狀;心肌常呈淡灰色,質軟有淤血,似開水煮樣;此外,部門病例還可見喉、氣管、支氣管等有輕度卡他性炎癥及腦充血、出血等現象[5]。根據該病的發病情況、臨床癥狀和病理變化可作出初步診斷。


2 實驗室診斷


2.1 病毒的分離和初步鑒定


  病毒初代分離一般使用鴨胚,在鴨胚中連續傳幾代后,很輕易在鴨胚中增殖,Levine和Fabricant(1950)首次用鴨胚分離DHV獲得成功。因目前海內尚無SPF鴨場,而鴨胚中又往往含有DHV母源抗體,妨礙病毒增殖,故試驗研究以及制作疫苗時接種和傳代常用SPF雞胚,病毒感染后主要表現為胚胎蜷縮,發育不良,全身水腫,體表充血且頭頸、背部等常有散在的針尖大小的出血點。肝臟為土黃、灰綠或鮮紅色,腫大、質脆,出血點顯著,邊沿壞死或在表面有灰綠色或黃白色壞死區,呈花斑狀,此外,有的雞胚尿囊液和卵黃囊還常呈綠色。胚體變化有一定的診斷意義。


  獲得高純度的病毒抗原可以對病毒進行電鏡直接觀察,并開展免疫學監測、診斷以及分子生物學研究。Taylor(1967)試圖以硫酸銨沉淀、超速離心方法對細胞增殖的DHV進行純化,但未能終極達到目的。以后良多學者嘗試著先離心初提,然后經氯仿抽提,PEG反透析濃縮蔗糖密度梯度離心等方法進行提純,以得到較為純凈的病毒,也未能如愿。楊奎以抗DHV IgG偶聯活化的Sepharose4B制成親和層析柱,提純感染致死的雛鴨肝臟勻漿中的病毒,電鏡下背景干凈,雜蛋白少,病毒大小約為40 nm,但病毒的特性未進一步驗證。孫剛等在電鏡下可見到直徑為32 nm~49 nm的病毒粒子,顆粒結構清楚,大小和結構均符合Ⅰ型DHV的特征。


  DHV因為病毒顆粒較小,得到較為純化的病毒一直困擾著研究者,良多學者通過各種提純的方法進行嘗試,但至今尚未見到一張切當的純化病毒的電鏡照片。


2.2 中和試驗


  因為至今尚未明確DHV的基因序列,因此該病的實驗室診斷主要依賴血清學中和試驗加以診斷。Levine P R等(1950)首先將中和試驗(Virus-neutralization test, VN)應用于DHV診斷鑒定,以后逐漸為各國學者所引用。通常在雞胚上以固定血清-稀釋病毒法進行,也有人在鴨胚、雛鴨或病毒適應細胞中進行試驗。Hwang記述了一種正確、可重復的Ⅰ型鴨肝炎病毒雞胚中和試驗。Woolcock P R等[9]首先報道了用中和抗體進行的空斑減少試驗,以為要比雞胚中和試驗敏感得多。Chalmers和Woolcock檢測了從16個非感染鴨收集的血清,其半數空斑減少滴度(VN)在1∶12到1∶250之間,均勻1∶59。他們建議陰性對照血清的最大空斑減少滴度應設為1∶250。Kaleta E F[10]用北京鴨腎細胞培養的DHV進行了微量中和試驗,既快速又易于判斷終點。陳琨等成功地在鴨胚單層肝細胞長進行了DHV-Ⅰ型的微量血清中和試驗,發現DHV形成CPE的能力可以被特異性血清中和,可以用于病毒鑒定、疫病診斷和免疫檢測。


  到目前為止,VN還是診斷鴨病毒性肝炎的最可靠的方法,該方法被以為是既特異又敏感,是公認的方法。缺點為啰嗦、費時,不能快速診斷,不適于基層應用。



2.3 瓊脂免疫擴散試驗


  Murty等(1961)首次報道采用瓊脂擴散試驗診斷DHV。通過不同間隔、不同濃度的抗原與高免血清沿瓊脂帶發生的瓊擴反應,可用來檢測病毒抗原的滴度。許偉琦等試驗表明在瓊脂中加入2%PEG能加快反映速度。張濟培等用瓊擴試驗檢測提純后的DHV,發現瓊脂凝膠配制的最佳方案是pH7.2,NaCl為80 g/L和瓊脂糖濃渡為10 g/L。瓊脂擴散試驗固然簡便易行,但正確性存在欠缺,并且有干擾,因此存在著一定的局限性。


2.4 間接血凝試驗


  司興奎等報道在純化DHV獲得較為滿足結果的基礎上,進一步應用純化抗原進行間接血凝試驗(IHA)。孫泉云等將初提DHV經Sephadex G200柱層析純化后作為致敏抗原,戊二醛法固定綿羊紅細胞,BDB法致敏抗原紅血球建立了檢測DHV抗體的IHA方法。IHA試驗敏感性高,所以致敏用抗原的純度要求高,而且必需保持良好的免疫活性。還有報道說21日齡前不易檢測到IHA抗體。所以對DHV早期診斷不合用。在敏感性和不亂性方面有波動,限制了該方法的推廣應用。


2.5 直接熒光抗體檢測


  Maiborda(1972)報道了快速和正確的診斷方法是接種雛鴨采用直接熒光抗體檢測(FA)。用FA確定了北京地區流行的DHV為I型。胡清海等用鴨胚細胞做成滴片進行FA檢測DHV。劉建采用感染新型鴨肝炎強毒后死亡鴨的腎細胞做滴片進行熒光染色,可檢測到病毒抗原存在,為臨床上快速診斷新型鴨病毒性肝炎提供了一種檢測方法。該方法正確簡便,但對設備要求較高。


2.6 雀斑免疫金滲濾法


  張小飛等[18]用膠體金標記提純后的兔抗鴨肝炎病毒(DHV)IgG,建立了一種以微孔濾膜為固相載體,以紅色膠體金為標記物的檢測DHV的雀斑免疫金滲濾法(DIGFA),并確定了最佳試驗前提。該法既可定性,亦可定量,對純化DHV的最小檢丈量為4.12 ng/點,其敏感性為抗原雀斑試驗(AST)的2倍。DIGFA 法具有敏感性高、特異性強、重復性好等長處。但其要求較高的抗原純度,這一點難以達到。


2.7 酶聯免疫吸附試驗


  應用酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)進行抗原、抗體的檢測,比較敏感、快速,已經廣泛應用于各種疾病的診斷。


  趙新柳等首次建立了間接ELISA法以檢測DHV抗體,結果表明,ELISA陽性檢出率為100%。陳溥言等[20]報道了DHV單克隆抗體的成功制備,并建立了檢測DHV的夾心ELISA方法,隨后范偉興等[21]用單克隆抗體建立了Dot-ELISA檢測方法。楊奎等用辣根過氧化物酶標記法成功地檢測了DHV抗體。該法與以polyomyl板或polystyrene為固相載體的ELISA法比擬,抗原用量少,很適于DHV這類難以提純的病毒的抗體檢測。孫泉云等將單抗的高度特異性與ELISA的高度敏捷性結合起來,建立了用以檢測DHV抗體的單抗捕獲法ELISA方法,該法能有效區分陰、陽性血清,非特異性背景很小。同時對抗原的純度要求也很低,甚至是尿囊液也能克服非特異性反應。楊萍萍等制備了DHV單克隆抗體,并用于檢測DHV。馬奇麗等[23]用辣根過氧化物酶標記純化的Ⅰ型DHV單克隆抗體建立了檢測DHV的Dot-ELISA法。


  良多學者建立了用以診斷DHV的ELISA方法,其長處是敏捷度高,操縱簡便,特異性強。但因病毒的純化和DHV陰性血清的制備等均存在一定難度,該方法在DVH的檢測診斷方面還未能得到廣泛的應用。


2.8 其他血清學診斷方法


  在DVH的診斷上除上述方法外,用來診斷鴨病毒性肝炎的方法還有被動血凝試驗,SPA協同凝集試驗,膠體金免疫電鏡技術,單克隆抗體-PAP法和核酸探針等方法,但因某些原因均還存在一定爭議,未能得到廣泛推廣和應用。


3 小結


  盡管多年來海內外良多學者對DHV進行了大量研究,但到目前為止,尚未能試探出一種便捷的提純程序,因而至今尚未得到純化的病毒,這就使病毒的深入研究大受限制,對其分子生物學特性的研究也難以著手。因此,繼承進行病毒提純方法的改進,將顯得尤為重要。


  對于DHV診斷方法的研究,已經取得了一定的成績,建立了很多基于血清學的診斷方法,基本能夠快速簡便地做出實驗室診斷,但基層應用存在一定的難題。也有良多學者建立了DHV的cDNA文庫,但還都有待于驗證,并未見公然的DHV序列報道。因此,應加緊其分子生物學研究,明確病毒的核苷酸序列,基因結構,編碼蛋白質的方式。用基因工程技術表達的重組抗原,或根據蛋白質分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列。人工合成的多肽片段抗原運用到免疫學檢測方法中,或建立一種快速而正確的分子生物學診斷方法,以解病毒是否存在著變異等挫折
 


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